Билет №27.
1)Иммуноферментный анализ (ИФА). В основе этого метода лежит присоединение к
анти-телам ферментной метки, что позволяет учитывать результат реакции антиген-
антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня.
В случае применения ИФА для поиска антигена, на стенках лунок адсорбируют
соответст-вующие антитела. Исследуемый материал вносят в лунку, при этом
антиген, взаимодействуя с антителами, фиксируется в ней. Лунки тщательно
промывают буферным раствором, чтобы удалить не адсорбировавшиеся вещества.
Затем вносят антитела против искомого антигена, меченные ферментом. Чаще всего в
качестве фермента-метки используют пероксидазу хрена. После инкубации лунку
снова промывают, чтобы удалить избыток меченных антител, если они не
удерживаются комплексом антиген-антитело, образовавшимся на предыдущем этапе. На
заключительном этапе в лунки вносят хромогенный субстрат (например, о-
фенилендиамин). Ферментативное расщепление субстрата приводит к образованию
окра-шенных продуктов реакции. Таким образом, изменение окраски содержимого
лунки будет свидетельствовать о положительном результате реакции: взаимодействие
антиген – антитело имело место. Иммуно-ферментный анализ или метод – выявление
антигенов с помощью соответствующих им анти-тел, конъюгированных с ферментом-
меткой. После соединения антигена с меченной фермен-том иммунной сывороткой в
смесь добавляют субстрат-хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется
цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорцио-нальна количеству
связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагно-стики вирусных,
бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций,
гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных
препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом
мате-риале.
При серодиагностике используются полистирольные планшеты, на стенках которых
заранее с помощью тех или иных методов адсорбируется ("нагружается") антиген.
Для предотвра-щения неспецифического связывания антител с полистиролом
оставшаяся свободной по-верхность полистирола подвергается специальной
обработке. Исследуемая сыворотка вно-сится в лунку планшета. При этом
гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела
удаляют промыванием. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов
(антител) человека, меченные ферментом. Если в исследуемой сыворотке
присутствовали искомые антитела, то они на данном этапе выступят в роли
антигенов, с ко-торыми прореагируют меченные антитела. Добавление после промывки
хромогенного суб-страта позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в
лунках.
Несомненным преимуществом иммуноферментного анализа перед классическими иммуно-
логическими реакциями (реакция агглютинации, РСК, РНГА) является возможность
количе-ственного анализа без использования серийных разведений. Интенсивность
окраски в лунке пропорциональна количеству фермента, а следовательно количеству
искомого ингредиента (антигена или антител). Измеряя оптическую плотность
жидкости в лунке и сравнивая ее с контролем можно легко определить концентрацию
искомого компонента. Еще одним досто-инством иммуноферментного анализа при
серодиагностике является возможность определе-ния классов специфических антител
(IgG, IgM, IgA), что имеет значение при определении фазы инфекционного процесса
и его остроты.
Радиоиммунный анализ (РИА) – один из методов количественного определения
биологи-чески активных веществ в биологических жидкостях. Был изобретен в 1950-х
годах прошлого столетия Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу. С его помощью
ученые изучали клиренс инсулина у больных диабетом. В 1977 году за выдающийся
вклад в развитие меди-цины Розалин Сасмен Ялоу была удостоена Нобелевской
премии. Широкое признание и по-пулярность метод получил в 80-е годы, особенно
для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов.
РИА основывается на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им
ме-ченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами, с
после-дующей их детекцией на специальных счетчиках, так называемых,
радиоспектрометрах. Та-ким образом, главное отличие радиоиммунного анализа от
иммуноферментного анализа (ИФА) заключается в том, что вместо фермента антитело
помечается изотопом. Как правило, для метки антител или антигенов чаще всего
используется изотоп йода 125, который имеет период полураспада 60 дней и высокую
удельную радиоактивность.
Диагностика посредством радиоиммунного анализа производится с целью обнаружения
тех же самых заболеваний, что и при помощи иммуноферментного анализа (смотрите
тему “Им-муноферментный анализ (ИФА)”).
Радиоиммунный анализ обладает довольно высокой чувствительностью и
специфичностью. Неоспоримым преимуществом РИА является возможность
стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении.
Что касается недостатков, то они, как правило, связываются с ограничениями,
определяемыми режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно коротким
сроком годности диагностического набора, что связа-но с распадом радиоактивной
метки. Кроме того, диагностика посредством радиоиммунного анализа
предусматривает наличие специализированной лаборатории, а также использование
дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).
Иммуноблоттинг (син. вестернблоттинг) - высокочувствительный метод выявления
белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.
Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле,
затем переносят их (блоттинг - от англ, blot, пятно) из геля на активированную
бумагу (1) или нит-роцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы
выпускают такие полоски с "блотами" антигенов. На эти полоски наносят сыворотку
больного (2). Затем, после инкуба-ции, отмывают от несвязавшихся антител
больного и наносят сыворотку против иммуногло-булинов человека, меченную
ферментом (3). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного +
антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4),
изменяющего окраску под действием фермента.
Таким образом, выявляются непосредственно белки вируса, который не только давно
выде-лен и сфотографирован, а ещё и является одним из наиболее изученных.
2)Для исследования берут кровь,биоптаты печени и проводят экспресс-
методы:*иммунохимический (иммунопреципитация в геле, РНГА, ИФА, РИА)
*малекулярно-биологический (ПЦР, ДНК-зондов) и серологические МИ. В сыворотке
крови обнаруживаются HBsAg-это поверхностный АГ HBV,который маркирует
инфицированность вирусом гепатита, и (HBeAg в незначительных количествах -это
ядерный «е»- АГ виру-са,указывающий на реплекацыю вируса в гепатоцитах,высокую
инфекционность крови и вы-сокий риск перинатальной передачи вируса.) IgM анти-
HBc-это АТ класса М к ядерному АГ,один из наиболее ранних сывороточных маркёров
ГВ, который указывает на острую ин-фекцию,при хр гВ маркирует репликацию НВV и
активность процесса в печени. При обост-рении хр ГВ будут обнаруживаться HBcAg-
это ядерный «core» АГ вируса,который маркирует репликацию вируса в
гепатоцитах,обнаруж-ся только при морфологическом исследовании биоптатов печени
и на аутопсии,а в свободном виде в крови не выявляется. Так же АТ к «е» АГ-
указывают на начало реконвалесценции,
3) Бифидумбактерин сухой.
Состав. Бифидумбактерин сухой представляет собой лиофильно высушенную в среде
куль-тивирования во флаконах, ампулах или спрессованную в таблетку микробную
массу живых, антагонистически активных штаммов Bifidobakterium bifidum № 1, 791
или ЛВА-3. Препарат имеет вид пористой или кристаллической массы бежевого или
беловато-серого цвета.
Выпускается в виде биомассы, лиофилизированной во флаконах по 5 доз, в ампулах
по 2 дозы и в таблетках по 10—20 штук ко флаконах или упаковке «Сервак» по 24
таблетки. Каж-дая таблетка — одна доза препарата.
Назначение. Препарат предназначен для лечения детей и с взрослых при
дисбактериозах кишечника, кишечных инфекциях, диарее и запорах, интоксикации,
после длительного при-менения антибиотиков и противоопухолевых препаратов,
радиационного облучения.
Способ применения и дозировка. Бифидумбактерин при кишечных заболеваниях
применя-ют через рот, а в акушерско-гинекологической практике интравагинально в
форме свечей. Содержимое флакона (ампулы) растворяют кипяченой водой комнатной
температуры из рас-чета: 1 чайная ложка на 1 дозу препарата. Необходимое
количество доз выпивают за 20—30 минут до еды. Грудным детям препарат можно
давать перед кормлением.
При кишечных заболеваниях детям первого полугодия жизни препарат назначают по 3
дозы на прием 3 раза в день. Детям второго полугодия и старше — по 5 доз 2 раза
в день.
Детям при сепсисе, пневмонии и других гнойно-инфекционных заболеваниях назначают
по 2—3 дозы 3 раза в день в комплексе с общепринятыми методами лечения основного
заболе-вания. При возникновении у данной группы детей нарушений функции
желудочно-кишечного тракта и угрозы язвенно-некротического энтероколита
дозировку бифидумбактерина увеличивают до 10 доз в сутки.
При острых и хронических воспалительных заболеваниях тонкого и толстого
кишечника, ко-литах и энтероколитах у взрослых рекомендуется по 5 доз 2—3 раза в
день. Длительность курса лечения бифидумбактерином определяется тяжестью
клинических проявлений, возрас-том больного и составляет 2—4 неделя, а в
отдельных случаях—до 3 месяцев.
С профилактической целью назначают по 5 доз 1-2 раза в день в течение 1-2
недель.
Реакция на введение. Применение бифидумбактерина не должно вызывать реакций.
Противопоказания для применения препарата отсутствуют.