шпаргалка

Билет №26.

[ Назад ]



1) Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со

специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (

флуоресцеинизотиоцианат , ро-дамин, В-изотицианит , лиссатинродамин В-200,

сульфохлорид и др.), имеющими реакцион-но-способные группы ( сульфохлорид ,

изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со сво-бодными аминогруппами молекул

антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к

соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ-АТ становятся хорошо

видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микро-скопом (рис. 7).

С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных

антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой метод.

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и

иден-тификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале.

Аг + АТ + электролит = светящийся в УФ

- лучах комплекс

Микроб сыворотка, меченная флюорохромом

Часто используют краситель изотиоционат флюоресциина - ФИТЦ

При исследовании этим методом используют люминесцентный микроскоп.

Постановка Р И Ф

На мазок наносят 30 мкл раствора ФИТЦ-меченных антител.

Помещают стекло во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в

течение 20-25 мин, или в термостате при 37° С в течение 15 мин.

Промывают стекло в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают

дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

На высушенный мазок наносят каплю монтирующей жидкости, мазок накрывают

покровным стеклом и микроскопируют с использованием люминесцентного микроскопа

или люминес-центной насадки к обычному оптическому микроскопу.



Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым

антителом. Непрямой метод - на поэтапном выявлении комплекса АГ-АТ с помощью

флуоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных

комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап - в

выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином .

Преимущество РИФ - простота, высокая чувствительность, скорость получения

результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа,

дизентерии, малярии, чу-мы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого

исследования используется люминес-центный микроскоп.

Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом

ма-териале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном

стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом,

ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав

диагностического набора. На поверх-ность фиксированного мазка наносят меченные

ФИТЦ сыворотки или моноклональые анти-тела (в случае непрямой РИФ, сначала

препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем меченными

антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ

является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяет-ся от другого

промывкой.

Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в

оп-тическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих

освеще-ние препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной

длинной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне

спектра. Исследователь оцени-вает характер свечения, форму, размер объектов и их

взаимное расположение.

Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то

непрямой ва-риант этой реакции может быть использован как для обнаружения

антигена, так и для серо-диагностики (например, при болезни Лайма, сифилисе). В

этом случае готовят мазки из эта-лонного штамма возбудителя. Исследуемую

сыворотку наносят на мазок. Если в ней присут-ствуют искомые антитела, то они

связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором

позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченной

сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положи-тельного результата

реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблю-дают

специфическое свечение эталонной культуры.

Основным недостатком РИФ является ее субъективность. Классическими критериями

специфичности этой реакции являются:

-характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;

-периферический характер свечения объекта;

-цвет флюоресценции;

-интенсивность флюоресценции.

При исследовании крупных объектов (трихомонады, гарднереллы, клетки пораженные

виру-сами) эти критерии позволяют получить высокодостоверный результат. В то же

время, эле-ментарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на

пределе разрешаю-щей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка

морфологии микроорга-низмов затруднена, а свечение теряет периферический

характер. Остающихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации

наблюдаемого микроорганизма. В связи с вы-шесказанным, субъективный характер

учета реакции предъявляет особые требования к ква-лификации персонала

проводящего исследования.

2)Заражение алиментарным путём. Указывают на гепатит А: работает продавцом на

овощ-ном рынке, правила гигиены соблюдает не всегда, иногда ест немытые фрукты.

Исключают другие вирусные гепатиты: За последние полгода парентеральных

вмешательств, посещений стоматолога и гинеколога не было. внебрачные связи

отрицает. Ранее гепатитом не болела.

Для подтверждения диагноза надо взять кровь, где обнаруживаются АТ к вирусу

гепатита класса М( анти-НАV IgМ или анти-ВГА IgМ)- иммуноферментного анализа

(ИФА) в сыво-ротке крови с первых дней болезни и далее в течение 3–6 мес. А так

же повышение в крови билирубина и печёночных ферментов аланинаминотрансферазы

(АлАТ) и аланинами-нотранспептидазы (АсАТ), высокий показатель тимоловой пробы.

3) Бруцеллин (brucellinum) — фильтрат 30-дневной бульонной культуры трех типов

бру-целл, применяемый в качестве аллергена для диагностики и специфического

лечения бру-целлеза.













КАТЕГОРИИ:

Network | английский | архитектура эвм | астрономия | аудит | биология | вычислительная математика | география | Гражданское право | демография | дискретная математика | законодательство | история | квантовая физика | компиляторы | КСЕ - Концепция современного естествознания | культурология | линейная алгебра | литература | математическая статистика | математический анализ | Международный стандарт финансовой отчетности МСФО | менеджмент | метрология | механика | немецкий | неорганическая химия | ОБЖ | общая физика | операционные системы | оптимизация в сапр | органическая химия | педагогика | политология | правоведение | прочие дисциплины | психология (методы) | радиоэлектроника | религия | русский | сертификация | сопромат | социология | теория вероятностей | управление в технических системах | физкультура | философия | фотография | французский | школьная математика | экология | экономика | экономика (словарь) | язык Assembler | язык Basic, VB | язык Pascal | язык Си, Си++ |