Билет №26.
1) Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)
РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со
специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (
флуоресцеинизотиоцианат , ро-дамин, В-изотицианит , лиссатинродамин В-200,
сульфохлорид и др.), имеющими реакцион-но-способные группы ( сульфохлорид ,
изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со сво-бодными аминогруппами молекул
антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к
соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ-АТ становятся хорошо
видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микро-скопом (рис. 7).
С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных
антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой метод.
Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и
иден-тификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале.
Аг + АТ + электролит = светящийся в УФ
- лучах комплекс
Микроб сыворотка, меченная флюорохромом
Часто используют краситель изотиоционат флюоресциина - ФИТЦ
При исследовании этим методом используют люминесцентный микроскоп.
Постановка Р И Ф
На мазок наносят 30 мкл раствора ФИТЦ-меченных антител.
Помещают стекло во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в
течение 20-25 мин, или в термостате при 37° С в течение 15 мин.
Промывают стекло в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают
дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
На высушенный мазок наносят каплю монтирующей жидкости, мазок накрывают
покровным стеклом и микроскопируют с использованием люминесцентного микроскопа
или люминес-центной насадки к обычному оптическому микроскопу.
Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым
антителом. Непрямой метод - на поэтапном выявлении комплекса АГ-АТ с помощью
флуоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных
комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап - в
выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином .
Преимущество РИФ - простота, высокая чувствительность, скорость получения
результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа,
дизентерии, малярии, чу-мы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого
исследования используется люминес-центный микроскоп.
Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом
ма-териале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном
стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом,
ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав
диагностического набора. На поверх-ность фиксированного мазка наносят меченные
ФИТЦ сыворотки или моноклональые анти-тела (в случае непрямой РИФ, сначала
препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем меченными
антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ
является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяет-ся от другого
промывкой.
Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в
оп-тическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих
освеще-ние препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной
длинной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне
спектра. Исследователь оцени-вает характер свечения, форму, размер объектов и их
взаимное расположение.
Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то
непрямой ва-риант этой реакции может быть использован как для обнаружения
антигена, так и для серо-диагностики (например, при болезни Лайма, сифилисе). В
этом случае готовят мазки из эта-лонного штамма возбудителя. Исследуемую
сыворотку наносят на мазок. Если в ней присут-ствуют искомые антитела, то они
связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором
позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченной
сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положи-тельного результата
реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблю-дают
специфическое свечение эталонной культуры.
Основным недостатком РИФ является ее субъективность. Классическими критериями
специфичности этой реакции являются:
-характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;
-периферический характер свечения объекта;
-цвет флюоресценции;
-интенсивность флюоресценции.
При исследовании крупных объектов (трихомонады, гарднереллы, клетки пораженные
виру-сами) эти критерии позволяют получить высокодостоверный результат. В то же
время, эле-ментарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на
пределе разрешаю-щей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка
морфологии микроорга-низмов затруднена, а свечение теряет периферический
характер. Остающихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации
наблюдаемого микроорганизма. В связи с вы-шесказанным, субъективный характер
учета реакции предъявляет особые требования к ква-лификации персонала
проводящего исследования.
2)Заражение алиментарным путём. Указывают на гепатит А: работает продавцом на
овощ-ном рынке, правила гигиены соблюдает не всегда, иногда ест немытые фрукты.
Исключают другие вирусные гепатиты: За последние полгода парентеральных
вмешательств, посещений стоматолога и гинеколога не было. внебрачные связи
отрицает. Ранее гепатитом не болела.
Для подтверждения диагноза надо взять кровь, где обнаруживаются АТ к вирусу
гепатита класса М( анти-НАV IgМ или анти-ВГА IgМ)- иммуноферментного анализа
(ИФА) в сыво-ротке крови с первых дней болезни и далее в течение 3–6 мес. А так
же повышение в крови билирубина и печёночных ферментов аланинаминотрансферазы
(АлАТ) и аланинами-нотранспептидазы (АсАТ), высокий показатель тимоловой пробы.
3) Бруцеллин (brucellinum) — фильтрат 30-дневной бульонной культуры трех типов
бру-целл, применяемый в качестве аллергена для диагностики и специфического
лечения бру-целлеза.