Билет №21.
1) Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических
исследовани-ях у больных и здоровых животных. С этой целью применяют
серологические методы (от лат serum - сыворотка и logos - учение), т. е. методы
изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген - антитело, определяемых
в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.
Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических
реак-ций в лабораториях. Реакция invitroмежду антигеном и антителом состоит из
специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое
специфическое свя-зывание активного центра антитела с детерминантой антигена.
Затем наступает неспецифи-ческая фаза — более медленная, которая проявляется
видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен
агглютинации) или преципитата в виде помутне-ния. Эта фаза требует наличия
определенных условий (электролитов, оптимального рН сре-ды).
Связывание детерминанты антигена (эпито-па) с активным центром Fab-фрагмента
антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и
гидрофобным взаимо-действием. Прочность и количество связавшегося антигена
антителами зависят от аф-финности, авидности антител и их валентности.
Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях
у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от
лат. serum— сыворотка и logos— учение), т. е. методы изучения антител и
антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и
других жидкостях, а также тканях организма.
Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя
позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также
для идентифи-кации антигенов микробов, различных биологически активных веществ,
групп крови, ткане-вых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов
клеток и др.
При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем
изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т.
е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические
антитела. Это так на-зываемая серологическая идентификация микроорганизмов.
В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации,
преципита-ции, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием
меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный,
иммунофлюорес-центный мето-ды). Перечисленные реакции различаются по
регистрируемому эффекту и технике постанов-ки, однако, все они основаны на
реакции взаимодействия антигена с антителом и применя-ются для выявления как
антител, так и антигенов. Реакции иммунитета характеризуются вы-сокой
чувствительностью и специфичностью.
Для определения антител или антигенов применяют следующие реакции антиген—
антитело: реакция агглютинации; реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации;
реакция коагглютинации; реакция Кумбса; реакция торможения гемагглютинации;
реакция преципитации; реакция нейтрализации; реакция связывания комплемента;
реакция радиаль-ного гемолиза; реакция иммуного прилипания; реакция
иммунофлюоресценции; иммуно-ферментный анализ; радиоиммунный метод, или анализ;
иммуноблоттинг; иммунная элек-тронная микроскопия.
РЕАКЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕЧЕННЫХ АТ И Аг
Реакции с использованием меченных антител и антигенов составляют основу методов
экс-пресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное
содержание Аг и АТ в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть
использованы различные ферменты, красители флюорохромы и изотопы.
Реакция иммунофлюоресценции
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, или метод Кунса). Различают три разновидности
ме-тода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом
экспресс-
диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.
Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные
им-мунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны
светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа (рис. 7.61). Бактерии в мазке,
обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в
виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген—антитело с помощью
а нти глобул и новой (против антител) сыворотки, меченной флюорохромом. Для
зтого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей
диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов,
отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок а нти
глобул и новой {антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами (рис. 7.62).
В результате образуется комплекс микроб + анти- микробные кроличьи антитела +
антикроличьи антитела, мечененные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в
люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Иммуноферментный анализ или метод — выявление антигенов с помощью соответст-
вующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-
га-лактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной
ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат
расщепляется фер-ментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность
окраски прямо пропорцио-нальна количеству связавшихся молекул антигена и
антител. ИФА применяют для диагно-стики вирусных, бактериальных и паразитарных
болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также
определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически
активных веществ, содержащихся в исследуемом мате-риале в минорных
концентрациях A010-10|? г/л).
Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции
(ан-тиген или антитело ) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках
планшеток из поли-стирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или
антигенов. При положи-тельном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз
после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты
путем промывания.
I. При определении антител {рис. 7.63) в лунки планшеток с сорбированным
антигеном по-следовательно добавляют сыворотку крови больного, анти глобул и
новую сыворотку, ме-ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.
IT. При определении антигена (рис, 7.64) в лунки с сорбированными антителами
вносят ан-тиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют
диагностическую сыво-ротку против него и вторичные антитела (против
диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для
фермента. Конкурентный ИФА для определения антигенов (рис. 7.65). Конкурентный
ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела
конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.
2) Возбудителями холеры являются два биовара холерного вибриона — классический
(Vibrio cholerae biovar cholerae) и Эль-Тор (Vibrio cholerae biovar eltor).,
которые относятся к сем. Vibrionаceae. Холера — острое инфекционное заболевание,
характеризующееся общей интоксикацией организма и острым гастроэнтеритом.
Чрезвычайно важна быстрая лабора-торная диагностика холеры, так как первые
случаи заболевания требуют бактериологическо-го подтверждения для своевременного
принятия эффективных противоэпидемических меро-приятий. Лабораторная диагностика
холеры проводится путем бактериоско-пического и бак-териологического
исследований. Трудности диагностики связаны с дифференциацией биоваров холерных
вибрионов от сходных с ними холероподобных вибрионов (Мечни-кова, Финклера,
Приора и др.), широко распространенных в природе и непатогенных для человека.
Материал для исследования: испражнения больного с подозрением на холеру, а)
микроско-пировать готовые мазки из исследуемой культуры; б) определить
подвижность культуры, выращенной на щелочной пептонной воде; в) отметить
результаты развернутой реакции агг-лютинации с О-противохолерной сывороткой; г)
отметить наличие или отсутствие роста ис-следуемой культуры на среде с
полимиксином и результаты гексаминового теста. Дать за-ключение по проведенным
исследованиям.
Бактериоскопическое исследование (схема 13). Из исследуемого материала
(испражнения, рвотные массы) готовят мазки, окрашивают по Граму и водным
фуксином. Кроме того, из нативного материала готовят препарат «висячая» капля, в
котором определяют наличие под-вижных вибрионов при обычной или фазово-
контрастной микроскопии. Обнаружение в маз-ках большого количества
грамотрицательных, слегка изогнутых палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и
активноподвижных вибрионов в препарате «висячая» капля позволяет дать первый
предварительный положительный ответ .
Бактериологическое исследование. Материал засевают в различные жидкие и на
плотные питательные среды, в частности, во флаконы со щелочной пептонной водой
(1% пептонная вода, 0,5% хлорида натрия, 0,01% KNOa и 0,2% Na2C03; рН 9,0), на
чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пептонной воде инкубируют при
37°С в течение 5—6 ч, на чашках — 10—12 ч. Из пленки, образующейся на пептонной
воде, или из поверхностного слоя делают мазки и препараты «раздавленная» и
«висячая» капля. Этот же материал ис-пользуется для постановки реакции
агглютинации на стекле со специфической противохо-лерной О-сывороткой. Часть
пептонной воды переносят в другую пробирку для постановки нитрозоиндоловой
пробы. Для этого добавляют несколько капель серной кислоты. В по-ложительном
случае появляется розовое окрашивание вследствие образования нитрозо-индола (из
индола и нитритов, которые образуются под влиянием холерного вибриона).
Независимо от результатов исследования делают пересев на вторую пептонную воду.
Нали-чие грамотрицательных вибрионов, агглютинирующихся О-сывороткой, позволяет
дать второй предварительный ответ. Независимо от полученных результатов
продолжают исследование, как показано.
Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят по 5-6 однотипным
колониям, выросшим на щелочном агаре. Для ускорения хода анализа ставят
развернутую реакцию агглютинации с бактериальной суспензией, приготовленной из
колоний. Для этого -агглютинирующую О-сыворотку разводят в пробирках до титра
пептонной водой (в объеме 0,5 мл). Затем в каждую пробирку вносят 1—2 капли
суспензии бактерий. Результат реакции агглютинации учитывают после 3-4-часовой
инкубации при 37°С. Окончательную иденти-фикацию культуры проводят на основании
определения чувствительности выделенных куль-тур к холерному фагу, их
гемолитических свойств, биохимической активности и агглютина-бельности
противохолерной О-сывороткой и типовыми агглютинирующими сыворотками Инаба и
Огава . Таким образом, идентификацию культур проводят в три этапа: 1) устанавли-
вают их принадлежность к роду Vibrio; 2) дифференцируют их от холероподобных
виб-рионов в реакции агглютинации с О-сывороткой, по чувствительности к
специфиче-скому фагу и другими тестами; 3) определяют видовые признаки культур .
Окончательное заключение о выделении и дифференцировании холерных вибрионов дают
через 36—48 ч на основании комплексного изучения основных биологических
признаков возбудителя.
Трудности при оценке результатов бактериологического исследования встречаются
при вы-делении атипичных холерных вибрионов и в первую очередь не
агглютинирующихся холер-ной О-сывороткой (НАГ-вибрионы). НАГ-вибрионы могут
лизироваться одним из специфи-ческих холерных фагов и обладать другими
свойствами, сходными с холерными вибрионами.
Ускоренные методы обнаружения холерных вибрионов.
1.Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами.
Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают
холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными
фагами. Готовят из них препараты <<раздавленная» капля, которые исследуют в
микроскопе, снабженном темнопольным или фазово-контрастным устройством. В
положительном случае через 3-5.-мин движение вибрионов прекращается.
2. Иммунофлюоресцентный метод. Препараты из исследуемого материала обрабатывают
флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микро-
скопе. Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже
единичных вибрионов с ярким желто-зеленым, свечением в виде блестящего ободка по
периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1—2 ч после
начала исследования при концентрации вибрионов не менее 106 клеток в 1 мл,
поэтому рекомендуется предвари-тельное подращивание материала на питательных
средах.
Серодиагностика. Серологическое исследование является вспомогательным и
применяется для ретроспективной диагностики холеры, выявления вибриононосителей
и оценки напря-женности постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Для
этого обычно ставят реакцию агглютинации или РПГА, а также определяют
вибриоцидные антитела в реакции лизиса in vitro.
3) Вакцина клещевого энцефалита культуральная сорбированная инактивированная
жидкая.
Состав. Вакцина содержит стерильную взвесь инактивированного формалином вируса
кле-щевого энцефалита, полученного путем репродукции его во взвеси клеток
эмбрионов курицы, сорбированного на гидроокиси алюминия. Должна иметь цвет от
розово-красного до красного.
Выпускается в жидкой форме в 2 мл ампулах, доза — 1 мл.
Назначение — для активной профилактики в выработки иммунитета к вирусу
клещевого энцефалита, а также для вакцинации доноров с целью получения
специфического иммуног-лобулина и иммунной плазмы для профилактики и лечения
клещевого энцефалита.
Способ введения и дозировка. Первичный курс вакцинации состоит из трех инъекций
пре-парата. Первые две проводят н ноябре—декабре, вторую — через 14—30 сут после
верной, третью — через 3 мес после второй (март — апрель), не позднее чем за 14
сут до посещения очага инфекции.
Для экстренной профилактики проводится двукратная вакцинация с интервалом от 30
до 60 сут. Последняя прививка должна быть проведена не позднее чем за 14 сут до
выхода в очаг инфекции.
Ежегодно необходимо проводить на протяжении 3 лет однократную ревакцинацию, но
не позже 14 суток до выхода в очаг. Если пропущены одна из ежегодных
ревакцинаций, допус-кается продолжение прививок, по выше указанной схеме, если
пропущены две ревакцинации, курс прививок проводят заново. Доза препарата для
детей 4-6 лет – 0,5 мл на инъекцию, для детей старше 6 лет и взрослых – 1 мл.
Вакцину вводят подкожно у нижнего угла лопатки.
Прививочные реакции. Вакцина вызывает кратковременное ощущение жжения, иногда
от-мечаются местные реакции в виде покраснения, болезненности, инфильтрата в
месте введе-ния. Продолжительность не превышает 5 суток. Общие реакции
продолжаются не более 3 су-ток и выражаются в повышении температуры, головной
боли, недомогания.
Противопоказания – острые инфекционные и неинфекционные заболевания, туберкулез
и ревматизм в активной форме, наследственные, дегенеративные о прогрессирующие
заболе-вания нервной системы, эпилепсия, аллергические реакции, хронические
заболевания печени и почек, сердечно-сосудистая недостаточность 2 и 3 степени,
перенесенные инфаркт миокар-да и инсульт, диабет и др эндокринные нарушения,
злокачественные новообразования, бо-лезнь крови, беременность.