Билет №19.
1) Иммунный статус — это структурное и функциональное состояние иммунной
сис¬темы индивидуума, определяемое комплек¬сом клинических и лабораторных
иммуно¬логических показателей.
Таким образом, иммунный статус ха¬рактеризует анатомо-функциональное состо¬яние
иммун-ной системы, т. е. ее способность к иммунному ответу на определенный
анти¬ген в данный момент времени.
Несмотря на вариабельность иммуноло¬гических показателей в норме, иммунный
статус можно определить путем постановки комплекса лабораторных тестов,
включаю¬щих оценку состояния факторов неспецифи¬ческой резистентности,
гуморального (В-система) и клеточ-ного (Т-система) иммунитета.
Оценка иммунного статуса проводится в кли¬нике при трансплантации органов и
тканей, аутоиммунных заболеваниях, аллергиях, для выявления иммунологической
недостаточнос¬ти при различных инфекционных и сомати¬ческих заболеваниях, для
контроля эффектив¬ности лечения болезней, связанных с наруше¬ниями иммунной
системы. В зависимости от возмож-ностей лаборатории оценка иммунного статуса
чаше всего базируется на определении ком-плекса следующих показателей:
1) общего клинического обследования;
2) состояния факторов естественной резис¬тентности;
3) гуморального иммунитета;
4) клеточного иммунитета;
5) дополнительных тестов.
При общем клиническом обследовании учи¬тывают жалобы пациента, анамнез, клиниче-
ские симптомы, результаты общего анализа крови (включая абсолютное число
лимфоци¬тов), данные биохимического исследования.
Гуморальный иммунитет определяют по уров¬ню иммуноглобулинов классов G, M, A, D,
Е в сыворотке крови, количеству специфических антител, катаболизму
иммуноглобулинов, ги-перчувствительности немедленного типа, пока¬зателю В-
лимфоцитов в периферической кро-ви, бласттрансформации В-лимфоцитов под
дейс¬твием В-клеточных митогенов и другим тес-там.
Состояние клеточного иммунитета оцени¬вают по количеству Т-лимфоцитов, а также
суб-популяций Т-лимфоцитов в периферичес¬кой крови, бласттрансформации Т-
лимфоци¬тов под действием Т-клеточных митогенов, определению гормонов тимуса,
уровню секретируемых цитокинов, а также постанов¬кой кожных проб с аллергенами,
контактной сенсибилизацией динитрохлорбензолом. Для постановки кожных
аллергических проб ис¬пользуются антигены, к которым в норме должна быть
сенсибилизация, например про¬ба Манту с туберкулином. Способность организма к
индукции первичного иммунного от¬вета может дать контактная сенсибилизация
динитрохлорбензолом.
В качестве дополнительных тестов для оценки иммунного статуса можно использовать
та-кие тесты, как определение бактерицидное™ сыво¬ротки крови, титрование СЗ-,
С4-компонентов комплемента, определение содержания С-реактивного белка в
сыворотке крови, определение ревматоидных факторов и других аутоантител.
Таким образом, оценка иммунного статуса про¬водится на основании постановки
большого чис¬ла лабораторных тестов, позволяющих оценить состояние как
гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, так и факторов
неспецифи¬ческой резистентности. Все тесты раз-делены на две группы: тесты 1-го
и 2-го уровня. Тесты 1-го уровня могут быть выполнены в любой клинической
иммуно¬логической лаборатории первичного звена здра¬воохранения, они
используются для первичного выявления лиц с явно выраженной иммунопато¬логией.
Для более точной диагностики использу¬ются тесты 2-го уровня.
С ПРАКТИКУМА:Оценка иммунного статуса включает количественную и качественную
оценку основных факторов неспецифической защиты и основных звеньев иммунной
системы: Т-лимфоцитов и их главных конечных продуктов – цитокинов; В-лимфоцитов
и их главных конечных продуктов – иммуноглобулинов. Оценку иммунного статуса
проводят в несколько этапов:
клинический анализ крови, который дает информацию о количестве циркулирующих в
крови гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов;
оценка активности неспецифических факторов иммунитета (макрофагально-
фагоцитарного звена иммунитета, системы комплемента, естественных киллеров,
системы интерферонов);
дифференцировка лимфоцитов на кластеры дифференциации по поверхностным CD-
маркерам;
анализ функциональной активности Т- и В-лимфоцитов;
определение концентрации иммуноглобулинов четырех основных изотипов.
Методы оценки неспецифической защиты организма
При оценке активности неспецифических факторов иммунитета используют несколько
мето-дов, направленных на:
- анализ активности макрофагально-фагоцитарного звена по показателям
фагоцитарного ин-декса и фагоцитарного числа, показателю авершеного фагоцитоза,
интенсивности окис-лительного взрыва в фагоцитах (НСТ-тест);
- определение количественного содержания комплемента в крови методом титрования;
- определение количества пропердина по степени сорбции комплемента на комплексе
зимо-зан-пропердин;
- определение количественного содержания лизоцима методом титрования или
фотометри-чески по уменьшению оптической плотности суспензии микрококка;
- определение бактерицидной активности сыворотки.
Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов.
красят по Романовскому-Гимзе и микроскопируют. Подсчет фагоцитированных
микробных клеток ведут в 200 нейтрофилах (50 моноцитах), рассчитывают
фагоцитарный индекс (про-цент фагоцитирующих лейкоцитов) и фагоцитарное число
(среднее число микробов, погло-щенных одним активным фагоцитом). Полученные
данные сравнивают с нормами (табл. 6).
Интенсивность реакции фагоцитоза для человека в норме
(нейтрофилы)
Показатели Дети Взрослые
Фагоцитарный индекс, % 60 75–80
Фагоцитарное число 12 14–15
Показатель завершенности фагоцитоза, % 50 55–60
НСТ-тест (индекс активности нейтрофилов) 0,1–0,15 0,1–0,15
НСТ-тест
В качестве косвенного показателя бактерицидности фагоцитирующих клеток оценивают
ин-тенсивность окислительного взрыва в фагоцитах по способности восстанавливать
желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ) с формированием в цитоплазме клеток
осадка темно-синео формазана (учитывают долю формазан-положительных клеток в
процентах). При инкубации лейкоцитов здоровых людей только с красителем доля
формазан-положительных клеток обычно не превышает 1–2 %, в присутствии
индукторов окислительного взрыва (клеток микроорганизмов, бактериальных
липополисахаридов и др.) может достигать 100 %. Снижение доли формазан-
положительных клеток свидетельствует о дефектности кислородзависимого механизма
бактерицидности фагоцитов.
Титрование комплемента.
Для определения титра комплемента исследуемую сыворотку разводят и добавляют
гемоли-тическую систему (смесь равных объемов эритроцитов барана и
гемолитической сыворотки). Пробирки инкубируют при 37ºС 30 минут, встряхивая
каждые 10 минут. Для контроля готовят разведения эритроцитов и дисиллированной
воды: 0,1 мл + 2,9 мл (соответствует 20 % гемолизу), 0,25 мл + 2,75 мл
(соответствует 50 % гемолизу), 0,35 мл + 2,65 мл (соответствует 70 %
гемолизу).Затем содержимое пробирки центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5
минут и определяют пробирку, соответствующую 50 % гемолизу. Количество
комплемента, внесенное в эту пробирку, делят на исходное разведение и узнают,
какое количество нераз-веденной сыворотки дает этот феномен. Полученная величина
будет соответствовать 1 еди-нице СН50. Вычисляют, сколько таких единиц будет в 1
мл неразведенной сыворотки (схема титрования комплемента приведена в
приложении). Показатели основных гуморальных фак-торов иммунитета здоровых людей
приведены .
Показатели основных гуморальных факторов иммунитета
здоровых людей
Показатели Дети Взрослые
Лизоцим, мкг/мл 5,4 3,8
Комплемент, СН50 30-50 60-80
Пропердин, ед 2-4 4-8
Дифференцировка лимфоцитов на кластеры дифференциации
по поверхностным CD-маркерам
Определение количества пропердина.
Опыт ставится в двух пробирках. Опытная содержит испытуемую сыворотку, зимозан и
ком-племент, контрольная – только испытуемую сыворотку и комплемент. Пробирки
инкубируют при 37ºС 60 минут. Далее в обеих пробирках по общепринятой методике
титрую комплемент. Титр комплемента в контрольной пробирке показывает, какое
количество комплемента было в опытной пробирке до образования комплекса
пропердин-зимозан. Титрование же компле-мента в опытной пробирке показывает
какое количество осталось несвязанным после образо-вания этого комплекса. По
разнице полученных единиц можно судить о количестве компле-мента, связанного
комплексом пропердин-зимозан. За 1 единицу пропердина принимается его
количество, которое полностью связывает весь комплемент в 1 мл сыворотки.
Изучение лимфоцитов начинается с их выделения из крови. Мононуклеарные лейкоциты
(лимфоциты, моноциты) отделяют от других клеток крови (гранулоцитов и
эритроцитов) центрифугированием в градиенте плотности специальной смеси
препаратов (фикол, верогра-фин). Имеющие большую плотность эритроциты и
гранулоциты образуют осадок на дне пробирки, а мононуклеарные клетки образуют
кольцо на поверхности градиентной смеси, откуда могут быть перенесены в
отдельную пробирку и отмыты от градиентной смеси. Диф-ференцировка популяций и
субпопуляций лимфоцитов связана с выявлением поверхностных CD-маркеров –
антигенов) помощью соответствующих специфических антител.
Количественное содержание лейкоцитов в циркулирующей
крови здоровых людей
Популяция/субпопуляция CD-маркер Процент от всего количе-ство лимфо-цитов
Абсолютное ко-личество клеток 109
в 1 л крови
Лимфоциты (всего) 100 1,50–3,50
Естественные киллеры 16 10 (5–15) 0,20–0,30
Т-лимфоциты (всего) 3 75 (60–90) 1,00–2,50
Т-хелперы 4 50 (32–65) 0,50–1,60
(Т-киллеры) 8 25 (16–39) 0,30–0,90
В-лимфоциты 19 15 (10–25) 0,30–0,90
Анализ функциональной активности Т- и В-лимфоцитов
Определение количества лимфоцитов разных популяций (субпопуляций) по
поверхностным маркерам проводится с помощью двух методик:
- люминесцентной или световой микроскопии мазков крови или взвеси мононуклеаров,
об-работанных соответствующими моноклональными антителами, меченными
флюорохромом или ферментом (для одного образца занимает неделю);
- автоматического подсчета клеток с использованием проточного цитофлюориметра
(для од-ного образца занимает несколько часов).
1. Функциональную полноценность Т-лимфоцитов косвенно оценивают с помощью кож-
но-аллергической пробы, отражающей интенсивность реакций ГЗТ в отношении
наиболее микробных антигенов (стрептококковых, туберкулина, дифтерийного
анатоксина). Антиген вводят внутрикожно и через 48 часов измеряют диаметр
инфильтрата – уплотнения, отра-жающий интенсивность реакции ГЗТ.
2. Для количественной оценки пролиферации Т- и В-лимфоцитов в ответ на
распознава-ние конкретного антигена оценивают пролиферативную активность клеток
в реакции бласт-трансформации лимфоцитов. Взвесь лимфоцитов обрабатывают
поликлональным митогеном (Т-лимфоциты – препаратом из растений семейства
Бобовые, В-лимфоциты – компонентами бактерий), инкубируют и добавляют 3Н-
тимидин. Через 2–3 суток инкубации измеряют включенную клетками радиоактивность
(3Н-тимидин включается в ДНК клеток при их ак-тивной пролиферации).
3. Функции Т-лимфоцитов оценивают по их способности продуцировать цитокины. Для
этого после активации культуры Т-лимфоцитов определяют типы цитокинов и их
количество в культуральной среде. Количество цитокинов определяют по их
биологической активности или выявляют как антигены с помощью специфических МКАТ
и ИФА.
4. Функции В-лимфоцитов косвенно оценивают по уровням иммуноглобулинов и изоге-
магглютининов в сыворотке крови.
Определение концентрации иммуноглобулинов четырех
основных изотипов
Содержание в сыворотке крови иммуноглобулинов четырех основных изотипов (IgG,
IgM, IgA, IgE) определяют, пользуясь наборами специфических антисывороток или
МКАТ, полу-ченных против изотип-специфических антигенов этих иммуноглобулинов.
Для определения количественного содержания иммуноглобулинов разных изотипов в
биологических жидко-стях используют радиальную иммунодиффузию (по Манчини),
твердофазный ИФА или РИА, метод иммунотурбидометрии.
Радиальная иммунодиффузия по Манчини. В геле, содержащем специфическую
антиглобу-линовую антисыворотку, делают лунки, которые заполняют исследуемыми
сыворотками. Из лунок молекулы иммуноглобулинов диффундирую в гель и образуют
кольца преципитации с соответствующими антииммуноглобулиновыми антителами.
Количественное содержание иммуноглобулинов устанавливают по диаметру колец
преципитации.
2)род Bordetella parapertussis,паракоклюш, склонна к пигментообраз-ю, колонии
больше размером,рост на Б-Жангу 1 сутки.
Ставят ориентировочную реакцию агглютинации с коклюшной и паракоклюшной сы-
воротками.!!!! Затем подозрительные колонии пересевают в пробирки для
дальнейшего изучения чистых культур бордетелл .
Установление серологической специфичности бордетелл, дифференциацию видов и
опреде-ление сероваров проводят в реакции агглютинации с адсорбированными
факторными сыво-ротками. При этом исходят из того, что антиген (фактор) 7
является родовым, а антиген (фактор) 1 присущ только В. pertussis, 14—В.
parapertussis и 12—В. bronchiseptica.
Бактериологическое исследование продолжается не менее 5 дней
В отличие от бордетелл Н. influenzae выращивается только на кровяных питательных
средах — кровяном агаре, «шоколадном» агаре Левинталя, содержащих Х-фактор
(гемин) и V-фактор (коэн-зим дегидрогеназы). Идентификацию выделенной культуры
производят на ос-новании комплексного изучения морфологических, культуральных,
биохимических и серо-логических свойств.
Серодиагностика. Реакция агглютинации и РСК применяются в основном для
ретроспек-тивного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики
атипичных форм кок-люша. Агглютинины в крови больных появляются на3—4-й неделе
заболевания в титрах 1 20 и выше. В условиях массовой вакцинации детей против
коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике
болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4—5 дней.
3)Вакцина туберкулезная (БЦЖ) сухая для внутрикожного введения.
Состав. Препарат представляет собой живые микобактерии вакционного штамма БЦЖ-1,
лиофилизированные в 1,5-ном растворе глутамината натрия. Пористая масса
порошкообраз-ная или в виде таблетки белого или кремового цвета.
Выпускается в ампулах, содержащих 1 мг препарата (20 доз по 0,05 мг) в комплекте
с рас-творителем — 0,9%-юным раствором хлорида натрия по 2 мл в ампуле; в
ампулах, содержа-щих 0,5 мг препарата (10 доз по 0,05 мг) в комплекте
растворителем — 0.9% -ным хлоридом натрия по 1 мл в ампуле. В одной коробке
содержится 5 ампул вакцины ВЦЖ и 5 ампул 0,9%-ного раствора хлорида натрия.
Назначение. Предназначена для активной специфической профилактики туберкулеза.
Ми-кобактерии, размножаясь в организме привитого, приводят к развитию
длительного специ-фического иммунитета к туберкулезу.
Способ введения и дозировка. Вакцину БЦЖ применяют внутрикожно в дозе 0,05 мг в
объ-еме 0,1 мл. Первичную вакцинацию осуществляют здоровым доношенным
новорожденным детям на 4—7-й день жизни в утренние часы после осмотра детей
педиатором. Ревакцинацию подлежат здоровые дети, подростки и взрослые в
декретированных возрастах (см. Приказ Министерства здравоохранения Российской
Федерации и Государственного Комитета сан-эпиднадзора 47—25 от 24.03.93 г.),
имеющие отрицательную реакцию Манту с 2 ТЕ ППД—Л. Реакция считается
отрицательной при полном отсутствии инфильтрата и гиперемии или при наличии
уколочной реакции (1 мм). Интервал между постановкой пробы Манту и ревак-
цинацией должен быть не менее 3 дней и не более 2 недель. Первую ревакцинацию
проводят в возрасте 6—7 лет (1 класс), вторую — 14—15 лет (8—9 класс). В
административных терри-ториях, имеющих напряженную эпидемиологическую ситуацию
по туберкулезу, сохраняется 3-кратный режим ревакцинации: 1 в возрасте 6—7 лег,
2 в возрасте 11—12 лет, 3 в возрасте 16 – 17 лет. Ревакцинацию взрослых (18—30
лет) необходимо осуществлять выборочно при показателях заболеваемости
туберкулезом 30 случаев и более на 100000 населения, охваты-вая наиболее
социально значимые группы населения в возрасте 21—22 и 27—30 лет.
Вакцину вводят строго внутрикожно на границе верхней и средней трети наружной
поверх-ности левого плеча после предварительной обработки кожи 70° спиртом. Иглу
вводят срезом вверх в поверхностный слой кожи. При правильной технике введения
образуется папула бе-ловатого цвета, которая обычно исчезает через 15 - 20
минут.
Прививочные реакции. На месте внутрикожного введения вакцины БЦЖ развивается
спе-цифическая реакция в виде папулы, везикулы или пустулы размером 5-10 мм в
диаметре. У новорожденных нормальная прививочная реакция появляется через 4 — 6
недель, а у ревак-цинированных через 1 - 2 недели и ранее. Реакции подвергаются
обратному развитию в тече-ние 2—З месяцев, а иногда в более длительные сроки. У
90 – 95% вакцинированных на месте прививки образуется рубчик размером до 10 мм
в диаметре. Осложнения после ревакцина-ции и вакцинации встречаются редко и
носят местный характер.
Противопоказания к вакцинации новорожденных: острые заболевания, внутриутробные
инфекции, родовые травмы, гемолитическая болезнь. недоношенность, незрелость
новорож-денных, генерализованная инфекция БЦЖ, выявленная у других детей в
семье.
Противопоказания к ревакцинации: острые инфекционные и неинфекционные заболева-
ния, обострение хронических заболеваний, в том числе аллергических,
иммунодефицитные состояния, злокачественные заболевания крови и новообразования,
заболевание туберкуле-зом и перенесенный туберкулез, положительная и
сомнительная реакция Манту с 2 ТЕ ППД—Л, осложненные реакции на предыдущее
введение вакцины БЦЖ, беременность.